3D打印半月板支架用于羊半月板再生

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膝关节中的半月板是股骨远端和胫骨近端髁间的新月形结缔组织，主要起到吸收机械力的作用。半月板损伤后一般行半月板切除术或半月板移植物替代治疗。半月板切除术容易暴露股骨和胫骨，进而导致过度磨损，这是骨关节炎的高度易感因素。而骨关节炎又是心力衰竭，脊髓损伤，呼吸系统疾病和中风中较为常见的慢性病因之一。一般来说，几乎所有纤维软骨组织的相关损伤和疾病，包括半月板，腱-骨连接处，脊柱的椎间盘和颞下颌关节的缺损均无法自发愈合。
   

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    与大多数其他复杂组织的再生相似，半月板再生的障碍是难以实现多种组织和细胞的再生。半月板由多种结缔组织细胞构成，包括外侧富含I型胶原基质中的成纤维细胞，以及内侧富含硫酸糖胺聚糖（GAG）和II型胶原基质中的软骨细胞组成。中部部位含有纤维软骨细胞，既分泌I型胶原也分泌II型胶原。前期的研究表明，利用单细胞难以实现包含复杂细胞群的半月板组织再生。此外，除了外侧，半月板的内侧与中部缺乏血供的问题也为半月板的修复带来了困难。
    在这篇研究中，作者设计了一种三维打印技术，仿生半月板异质结构，在半月板外侧与内侧两个特定的区域缓释两种不同的生长因子，诱导两个区域分泌不同的细胞外基质，从而促进半月的再生与修复。
    结果与讨论：
    第一部分
    rhCTGF和rhTGFβ3因子用于诱导MSCs细胞成纤维软骨分化
    设计依次用rhCTGF和rhTGFβ3两种因子按照不同的顺序处理MSCs细胞，然后研究细胞成纤维分化情况，主要检测其中COL-I，COL-II和蛋白聚糖（AGC）的表达。结果表明rhCTGF促进II型胶原和AGC的表达，而rhTGFβ3促进I型胶原的表达。

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    图1（A）利用rhCTGF和rhTGFβ3两种因子依次处理MSCs细胞后的proCOL-I和proCOL-IIα的免疫荧光分析（C→T（rhCTGF处理2周，然后rhTGFβ3处理2周），T→C（rhTGFβ3处理2周，然后rhCTGF处理2周），C+T（rhCTGF和TGFβ3同时处理4周），C4（rhCTGF单独处理4周）和T4（rhTGFβ3单独处理4周））。
    （B）至（D）为MSCs在经过（A）步骤处理后细胞的COL-I，COL-II和AGC的相对mRNA表达分析。
    第二部分
    3d打印人半月板支架及体外表征
    利用3D打印技术打印聚己内酯（PCL）材料得到人体半月板形状框架，然后将聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）微球作为缓释材料分别包裹rhCTGF和rhTGFβ3两种因子填充到3D打印半月板框架的外侧与内侧，最终得到人半月板支架，此外，同样打印不负载两种因子的3D打印半月板支架（负载空白PLGA微球）作为对照组。体外缓释实验表明两种因子均有良好的缓释行为。体外种植人滑膜MSCs细胞培养6周后，发现在支架的外侧有大量I型胶原表达，而内侧有大量II型胶原表达，这与大鼠的半月板结构一致。体外种植1:1混合成纤维细胞与软骨细胞培养6周后，阿辛蓝染色（观察蛋白聚糖）、天狼星红染色（观察I和III型胶原蛋白）以及免疫荧光染色（观察I型和II型胶原蛋白）均表明该人半月板支架的外侧有较多I型胶原表达，内侧有较多II型胶原和蛋白聚糖表达，二者连接处有较为明显的移行区界面，符合人体半月板结构特征。

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    图2（A）3D打印人体半月板框架结构。
    （B）分别包裹rhCTGF和rhTGFβ3的PLGA微球（μS）被填充到3D打印半月板支架的框架内，并粘附在PCL纤维表面。
    （C）分别将CTGF（绿色，40kD）和TGFβ3（红色，10kD）进行荧光标记，显示两种因子被分别负载在人半月板支架的外部与内部区域。
    （D）人半月板支架中的hCTGF和rhTGFβ3体外缓释数据。
    （E）支架在人滑膜MSCs细胞在支架上培养6周后，缓释的rhCTGF和rhTGFβ3分别诱导细胞在特定区域表达I型和II型胶原，该结构类似于大鼠半月板。
    （F）在人半月板支架上体外种植1:1混合成纤维细胞与软骨细胞，培养6周后对应阿辛蓝染色、天狼星红染色以及免疫荧光染色结果。
    第三部分
    3D打印羊半月板支架及体内试验
    根据羊尸体上的天然半月板三维模型数据，3D打印PCL半月板形状支架，然后分别在内外侧负载rhCTGF和rhTGFβ3两种因子。得到羊半月板支架后进行力学分析发现该支架有着较羊天然半月板更好的动态模量（E*），储能模量（E'）和损耗模量（E“）。手术将其植入到羊内侧半月板部位。12周后取出，数码照片和HE染色结果显示股骨与胫骨髁上的关节软骨几乎没有损伤（图3）。再生半月板取出后分别进行HE染色、天狼星红染色和阿辛蓝染色（图4），结果表明相比于不负载因子的3D打印半月板支架，负载呈特定区域分布的两种因子的3D打印半月板支架在经过12周的修复后有着明显更加接近于天然半月板的胶原纤维和软骨基质表达。具体是，实验组的外侧有较多I型胶原表达，内侧有较多II型胶原和蛋白聚糖表达，符合羊天然半月板结构特征。

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    图3（A）羊半月板的三维扫描，重建以及3D打印获得羊半月板支架。
    （B）3D打印羊半月板支架与天然半月板的动态模量（E*），储能模量（E'）和损耗模量（E“）对比。
    （C）2-0缝合线对支架和天然半月板外缘的缝合后拉拔强度。
    （D）支架和天然半月板的摩擦系数。
    （E）羊半月板内侧手术移植。
    （F）手术12周后取出的数码照片与HE染色结果。

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    图4（A）羊天然半月板中胶原纤维和软骨基质的分布。
    （B和C）体内移植12周后，可释放的rhCTGF和rhTGFβ3的实验组（B）与对照组（C）相比的特定区域组织学染色。组织切片用H＆E，阿辛蓝（AB）和天狼星红（PR）染色。
    （D）再生半月板外侧，中部，内侧的HE染色结果。
    （E）在体内植入12周后，对照组与实验组组织学染色的低倍率图。
    将移植12周后再生的羊半月板（对照组与实验组）和天然半月板分别分为外侧，中部，内侧三个部分，并依次进行应力松弛试验力学测试，得到各组各个区域的瞬时模量（Ei）、松弛模量（Er）和粘度系数（μ）力学数据。同时对三组进行拉伸力学测试，得到杨氏模量、极限强度和极限应变力学数据。结果表明，在相关力学测试结果中，实验组的力学性能均好于对照组，且接近天然半月板组织。
   

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    图5移植12周后再生的羊半月板（对照组与实验组）和天然半月板在各个区域（外侧，中部，内侧）的瞬时模量（Ei）、松弛模量（Er）和粘度系数（μ）。
    （B）三组的拉伸杨氏模量、极限强度和极限应变数据。
    总结：
    1.作者提出天然半月板分为内侧和外侧两个结构，而且这两个部分的胶原纤维和软骨基质成分以及细胞类型不同，外侧富含I型胶原基质和成纤维细胞，内侧富含蛋白聚糖、II型胶原基质和软骨细胞。复杂的基质成分和细胞组成成为当前半月板再生的难题。
    2.作者通过设计体外诱导MSCs细胞成纤维软骨细胞分化，结果表明rhCTGF促进II型胶原的表达，而rhTGFβ3促进I型胶原的表达。这是该项研究的理论基础。
    3.结合PLGA微球缓释技术和3D打印技术，制备可以在不同区域分别缓释rhCTGF和rhTGFβ3两种生长因子的3D打印人半月板支架，并体外证明该支架可以诱导细胞在其外侧表达I型胶原，内侧表达II型胶原和蛋白聚糖。
    4.构建羊半月板缺损模型，并将3D打印羊半月板支架体内移植。培养12周后发现相比于空白对照组，负载呈特定区域分布的两种因子的3D打印半月板支架在经过12周的修复后有着明显更加接近于天然半月板的胶原纤维和软骨基质表达。同时力学实验表明实验组支架移植后的结果更好，表明了该支架对半月板再生的应用潜力。

(责任编辑：中国3D打印网)